서론
구강 내 조직은 상피세포로 덮여 있으며, 이는 인체 내 조직 중 창상의 회복이 가장 빠르게 일어나는 기관이다. 하지만, 구강 내에는 수많은 미생물들이 존재한다. 또한, 구강은 섭식을 위한 통로가 되며, 온도, pH 등 환경이 자주 변하는 기관이다[1]. 이러한 구강의 특성 때문에 외상 등으로 인해 구강 내 창상이 발생하였을 때, 구강 내 환경변화에 의해 창상부의 연조직이 지속적으로 자극받게 되면, 감염 등이 발생하여 창상 치유에 영향을 미칠 수 있다[2]. 따라서, 창상 후 구강 내 환경변화로부터 창상부를 보호하고, 창상 발생 초기부터 창상의 회복을 도울 수 있는 제품의 개발이 필요하다.
Ginsenoside는 인삼의 대표적인 구성 성분으로 여러 연구들을 통해 항알츠하이머, 항혈관성 치매, 항전이, 항염증 효능 및 면역증진작용 등의 유용한 약리적 효과를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다[3]. Ginsenoside에는 총 18 개의 유도체가 있는데, 이는 각각 Ginsenoside Ro, Ra1, Ra2, Ra3, Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, R1, Rf이다. 이 중 Ginsenoside Rb1의 항염증 작용 및 창상 치유 촉진 효과에 대한 연구들이 보고되어 왔다. Wei 등[4]은 Lipopolysaccharide를 처리하여 염증을 유발한 인간태아폐세포에 Ginsenoside Rb1을 적용 시, NF-κB pathway를 저해하여 염증 발현이 줄어들었다고 보고하였다. Zhang 등[5]은 쥐를 이용한 화상모델을 만들었고, 화상을 입은 피부에 Ginsenoside Rb1을 적용 시 대조군에 비하여 높은 치유율을 나타냈으며, 이는 Ginsenoside Rb1을 화상부위에 적용 시 회복 과정에서 나타나는 대표적인 성장인자인 fibroblast growth factor, platelet-derived growth factor의 발현을 촉진시켜 치유를 도왔다고 보고하였다. 선행 연구의 결과를 토대로 Ginsenoside Rb1의 창상 치유 촉진능이 확인되었으나, 오늘날까지 구강 내 창상에서의 효능을 입증한 선행 연구는 없었다.
Carboxymethyl cellulose (CMC)는 독성이 없고, 수용성으로 물이나 타액과 같은 액체에 닿게 되면 점착성을 띠는 겔의 형태로 변하게 된다. 독성이 없고, 점착성을 띠는 성질을 이용하여 약물의 운반체로 사용되고 있다[6].
안구는 습윤하고, 끊임없는 움직임이 존재하며, 눈꺼풀에 의한 자극이 존재하는 기관이다. 구강 역시 안구와 마찬가지로 타액에 의해 습윤하고, 저작과 연하 등의 움직임이 존재하며 혀에 의한 자극이 존재하는 기관이다. Hyaluronic acid (HA)는 생체친화적이고 유동성을 띠는 물질로 안과 영역에서 다양한 약물과 혼합하여 약물의 운반체 역할로 사용되고 있다[7].
이 연구의 목적은 CMC와 HA를 약물 운반체로 이용하여 Ginsenoside Rb1이 구강 내 창상 치유에 미치는 영향을 알아보는 것이다.
연구 재료 및 방법
1. Ginsenoside Rb1 함유 필름의 제작
한국한의약진흥원 산하 한의약소재은행의 순도 100% Ginsenoside Rb1 powder (CAS number: 41753-43-9)를 ㈜진우바이오에 의뢰하여 성분이 다른 두 종류의 직경 8 mm 원형 필름을 제작하였다[8]. 첫 번째 필름은 Ginsenoside Rb1-loaded carboxymethyl cellulose (GCMC) film이며, 두 번 째 필름은 Ginsenoside Rb1-loaded hyaluronic acid film(GHA) film이다. GCMC film은 CMC를 3차 증류수에 용해시켜 2% CMC gel을 제작한 후 20 μmol/L의 Ginsenoside Rb1을 섞어 캐스팅 후 건조하여 제작하였다. GHA film은 HA를 3차 증류수에 용해시켜 6% HA gel을 제작한 후 마찬가지로 20 μmol/L의 Ginsenoside Rb1을 섞어 캐스팅 후 건조하여 제작하였다. 이때, Song 등[9]의 이전 연구를 참고하여, 각각의 film에 함유하는 Ginsenoside Rb1의 농도는 20 μmol/L로 결정하였다.
2. 동물 실험 과정
이 연구는 경희의료원 동물실험윤리위원회의 검토 및 승인하에 진행되었다(KHMC-IACUC-2021-014). 10주령의 250 - 300 g 중량을 가진 Sprague-Dawley rats (Youngbio, Seongnam, Korea) 36마리를 각 군당 12마리씩 대조군, GCMC film군, GHA film군으로 무작위로 나누어 배정하였다. 다시 각 군 안에서 7일 희생군, 21일 희생군으로 6마리씩으로 나누어 총 6개의 군으로 연구를 진행하였다(Table 1). 동물실험은 다음과 같은 순서로 진행되었다. Spraque-Dawley rat을 이용한 선행 연구에서 사용한 방법과 마찬가지로, Zoletil 50 (Virbac Lab, Carros, France)을 30 mg/kg의 농도로 복강 내 주사하여 마취를 유도한 후 2% 클로르헥시딘 용액으로 실험 동물의 구강 내 소독을 시행하였다. 충분한 마취 상태에 도달한 뒤 실험 동물의 상악 정중구개부에 일회용 biopsy punch를 이용하여 하나의 직경 5 mm의 표준화된 전층 판막을 형성하였다. 그 후 멸균된 면봉과 거즈를 이용하여 압박 지혈을 시행하였고, 대조군에는 아무 처치도 시행하지 않았고, GCMC film군과 GHA film군에는 각각 실험 물질을 적용하였다(Fig. 1). 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는 추가적인 감염의 관리를 위해 실험 종료 후 20,000 IU의 penicillin G (Penicillin G potassium salt, Sigma-Aldrich, Yongin, Korea)를 근육 내 주사하였다. 군에 따라 실험 7일 및 21일 뒤 각 군의 실험 개체는 zoletil 50의 통상 마취 용량의 3배 이상(90 mg/kg)의 과다 투여로 안락사 시행하였으며, 임상 및 조직학적 분석을 위해 실험 동물들의 사체로부터 시편을 채취하였다.
3. 결과 분석 방법
1) 임상적 분석 희생 시 촬영한 시편 사진을 통해 창상의 재상피화가 일어 나지 않은 면적을 계산하여 임상적인 치유율(healing rate)을 계산하였다. 확대율 보정을 위해 한 칸의 길이가 1 mm인 모눈종이 위에 시편을 올려놓고 사진을 촬영하였다. 면적의 계산에는 ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)가 사용되었고, biopsy punch의 크기인 직경 5 mm의 원의 pixel 값을 측정한 후 재상피화가 일어나지 않은 면적의 pixel 값을 측정하였다(Fig. 2).
2) 조직학적 분석
조직학적 분석을 위한 시편은 채취 직후 10% 포름알데하이드에 고정 후 조직표본 제작을 위해 2 mm 두께로 관상면(Coronal plane)을 따라 조직 다듬기(Tissue trimming)를 실시하였다[10]. 다듬기를 실시한 시편은 조직처리(STP120; Spin tissue processor, Myr, Tarragona, Spain)를 실시한 후 박절기를 이용하여 약 3 ㎛ 두께로 박절하여, 얻어진 절편을 슬라이드에 부착하여 건조 후 탈파라핀, 함수 과정을 거쳐 증류수로 세척하였다. 조직학적으로 collagen의 합성을 관찰하기 위해 Masson’s Trichrome stain을 시행한 후 슬라이드를 Motic easyscan one (Motic Asia, Hongkong, China)으로 스캔하였고 이를 Motic Digital Slide Assistant software (Motic China Group Co., Ltd. 2017, Hong Kong, China)를 통하여 분석하였다. 창상의 변연 사이 거리(Soft tissue gap)를 측정하였고, 조직에서 Collagen이 염색된 면적의 백분율(Collagen positive % area)을 측정하였다. Soft tissue gap은 Chaushu 등[10]의 연구에서 사용한 방법에 착안하여 슬라이드 상 관찰되는 창상의 양측 변연에 교합평면의 수직방향으로 접선을 긋고 그 사이 의 거리로 정의하였다. Collagen positive % area는 Xu 등[11]의 연구에서 사용한 방법에 착안하여 창상의 치유가 창상연에서 중심방향으로 일어나므로 관심 영역(Region of Interest)을 창상의 변연부에 한 변의 길이가 0.4 mm인 정사각형으로 결정한 후 관심 영역 내에서의 Collagen fiber가 염색된 pixel을 ImageJ software (National Institutes of Health)를 이용하여 측정하여 전체 면적 중 collagen 생성 면적의 백분율로 정의하였다(Fig. 3).
3) 통계 분석
임상적 치유율 평가와 조직학적 분석 결과값 중 Soft tissue gap 평가를 위해 숙련된 2명의 평가자가 평가를 시행하였고 평가자간 일치도를 의미하는 Intra-class coefficient (ICC) value는 각각 0.977, 0.991로 높은 신뢰도를 나타냈다.
결과값들은 IBM SPSS Statics 20 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 통계적으로 분석되었다. Kruskal-Wallis test시행 후, Mann-Whitney’s U test로 사후검정을 시행하였다(α = 0.05).
연구 성적
1. 임상적 분석
재상피화가 일어나지 않은 면적을 계산하여 얻은 임상적 분석 결과에서는 7일 희생군에서 GCMC군(81.1 ± 13.5%)이 GHA군(45.2 ± 21.6%)과 대조군(48.4 ± 3.03%)에 비하여 더 높은 치유율을 나타냈다(p < 0.05). 21일 희생군에서는 각 군 간에 통계적으로 유의미한 차이가 없었다(Fig. 4).
2. 조직학적 분석
1) Soft tissue gap (mm)
7일 희생군에서 GCMC군(0.71 ± 0.70 mm)이 GHA군(2.09 ± 0.81 mm)과 대조군(2.67 ± 0.56 mm)에 비하여 soft tissue gap이 낮은 값을 나타냈다(p < 0.05). 21일 희생군에서는 각 군 간의 통계적으로 유의미한 차이가 발생하지 않았다(Fig. 5).
2) Collagen positive area (%)
7일 희생군에서 GCMC군(9.74 ± 10.12%)과 GHA군(19.5 ± 14.47%)이 대조군(0.89 ± 1.60%)에 비하여 collagen positive area가 높은 값을 나타냈다(p < 0.05). 21일 희생군에서는 각 군 간의 통계적으로 유의미한 차이가 발생하지 않았다(Fig. 6).
총괄 및 고찰
Ginsenoside Rb1은 염증반응을 일으키는 경로인 NF-κB pathway를 저해하여 염증의 발현을 줄이고, 창상의 회복과정에서 나타나는 대표적인 성장인자인 fibroblast growth factor와 platelet-derived growth factor의 발현을 촉진하여 창상의 치유를 촉진하는 역할을 하는 물질로 알려져 있다[4,5]. 하지만 이러한 특성은 세포실험과 피부의 상피조직을 이용한 연구를 통해 밝혀진 결과이고, 구강 내 조직에 대해서도 창상치유촉진능을 갖고 있는지에 대해 보고된 연구는 현재까지 거의 존재하지 않는다.
구강은 타액 등에 의해 습윤하고 여러 미생물들이 존재하는 환경이다. 이러한 특성으로 인하여 구강 내 창상이 발생하였을 때, 감염 등의 부작용이 나타날 가능성이 있다. 이러한 부작용을 방지함과 동시에 창상 치유를 촉진하는 물질을 안정적으로 전달할 매개체가 필요하다. 따라서 이 연구는 구강 내 창상 치유 촉진을 위해 사용할 수 있는 생체 친화적이고 시술 편의적인 제품의 개발을 위해 진행되었다. CMC는 혈액, 농, 타액 등의 액체를 흡수할 수 있고, 액체를 흡수함으로써 창상부위 뿐만 아니라 정상조직에도 접착성을 띠는 물질이다[12]. 또한 HA는 생체친화적이고, 독성이 없는 인체의 세포 외 기질을 이루고 있는 물질로, 많은 연구들에서 약물 전달용 매개체로 쓰이고 있다[13-15]. 이러한 특성들을 고려하여, 이 연구에서는 Ginsenoside Rb1을 전달할 운반체로 CMC와 HA를 사용하였다.
임상적 분석에서 7일 희생군의 GCMC 군이 대조군이나 GHA 군보다 창상의 재상피화가 더 넓은 면적에서 나타나 높은 치유율을 나타냈다. Weinberg 등[16]은 쥐의 둥근 형태의 구개면 창상이 회복되는 양상을 설명하는 지퍼 이론을 제시하였다. 그는 창상의 회복은 양쪽에서 지퍼를 채우는 것과 같은 모양으로 우선 전후방의 창상이 먼저 치유되고, 횡적인 치유는 그 후에 일어난다고 보고하였다. 창상의 치유가 전후방에서 먼저 일어나는 양상이 이 연구에서도 동일하게 나타났다(see Fig. 4). 임상적 분석을 통해 Ginsenoside Rb1을 포함한 CMC film이 HA film과 대조군보다 더 높은 치유율을 보였으므로, CMC film이 HA film보다 Ginsenoside Rb1의 치유촉진능을 창상에 잘 전달해줄 수 있을 것으로 사료된다.
조직학적 분석에서 Soft tissue gap은 Ginsenoside Rb1이 포함된 실험군에서 대조군에 비해 작게 나타났다. 이는 실험군에서 창상의 치유가 잘 이루어졌다는 것을 의미한다. 이는 쥐의 화상 부위에 Ginsenoside Rb1을 적용한 Kimura 등[17]의 이전 연구와 유사했다. 그의 연구에서 Ginsenoside Rb1은 염증 반응을 저해하고, 혈관 생성을 촉진함으로써 창상 치유를 촉진한 것으로 보고되었다.
HA는 피부의 세포 외 기질의 주성분으로, 염증반응을 저해하고, 신혈관 생성과 조직의 재생에 관여하면서 창상의 치유를 촉진하는 역할을 하며 반흔의 형성도 억제하는 효과가 있다고 알려져 있다[18-21]. 이 연구에서 약물 운반을 위한 매개체로 사용되었지만, 조직학적 분석 결과, 창상 치유 촉진에 있어 GHA 군은 GCMC 군보다 효과가 유의미하게 작았다. 그러나, 이는 이 연구의 실험 방법 상 조직 다듬기가 관상면을 따라 평행하게 이루어졌기 때문에, Weinberg의 지퍼 이론에 입각하여 볼 때, 2군 간의 정확한 치유 효과 차이를 보는데 한계가 있었을 것으로 추정된다. 또한, Ginsenoside Rb1과 HA 간의 상호작용에 대한 고려가 필요할 수 있다. 추후의 연구에서 이 2가지 물질 간의 상호작용에 대해 알아보는 것이 필요할 것이다.
Collagen은 세포 외 기질의 주성분으로 조직에 탄성을 부여는 역할을 하며, 창상의 치유 과정에 있어서 collagen의 합성은 필수적인 요소로 알려져있다[22]. 이 연구에서, 7일 희생군에서 아직 상피화가 일어나지 않은 창상의 margin 부위에서 collagen positive area를 계산해 보았을 때, 대조군에 비해 GHA 군과 GCMC 군 모두 Collagen이 많이 관찰된다는 것을 알 수 있다. 이를 통하여, Ginsenoside Rb1을 포함한 CMC film과 HA film 모두 구강 내 창상 치유 시 collagen의 합성을 촉진하는 것을 추정할 수 있다.
다른 신체 부위에 발생한 창상에서 Ginsenoside Rb1이 창상치유촉진능을 갖는다는 선행 연구의 결과를 바탕으로 진행한 이 연구에서 동물실험을 통해 Ginsenoside Rb1을 포함한 CMC film과 HA film이 구강 내 창상에도 유사한 치유촉진능을 가진다는 것을 확인하였다. 또한, Ginsenoside Rb1을 안정적으로 창상 부위에 적용시킬 수 있는 약물 운반체로써 CMC film이 HA film보다 임상적 측면 및 조직학적 분석 창상의 변연 사이 거리 측면에서 우수한 치유 효과를 나타냈다. 따라서, Ginsenoside Rb1을 함유한 CMC film이 구강 내 창상 치유에 대해 재상피화 측면에서 유리하고, 보다 안정적으로 Ginsenoside Rb1을 창상 부위에 전달할 수 있을 것으로 예측된다. 제품 상용화를 위한 개발 단계에서 Ginsenoside Rb1의 약물 운반체로 HA film보다 CMC film을 사용하는 것이 바람직할 것이라고 평가된다.
이 연구의 한계점은 다음과 같다. 첫째로, 대조군은 창상의 형성 후 아무 처치도 하지 않은 음성 대조군 밖에 없었다. 창상의 형성 후 아무 물질도 포함되지 않은 CMC film을 적용하는 위약 실험군 또한 설정하였다면 창상 치유의 촉진이 Ginsenoside Rb1에 의해 일어났는지 명확하게 밝혀낼 수 있었을 것이다. 둘째로, 평가 시점이 1주, 3주로 두 시점밖에 없고, 3주에선 모든 군에서 창상의 회복이 거의 이루어졌기 때문에 세세한 치유 과정에 대한 정보가 부족한 한계가 존재한다. 추후의 연구에서는 평가 과정을 세분화해서 진행한다면, 창상의 치유 초기, 중기, 후기 등 각 시기마다 Ginsenoside Rb1이 나타내는 창상 치유촉진능에 대해 보다 자세한 평가가 가능할 것으로 사료된다.
PDF Links
PubReader
ePub Link
Full text via DOI
Download Citation
Print
